13. Fonction de la sous-unité $\alpha$6 dans la locomotion induite par la nicotine

13.1 Effets de la nicotine sur la locomotion

Les effets de la nicotine sur la locomotion sont pluriels [311]. La nicotine est anxiogène. Ainsi, dans un environnement nouveau, la nicotine entraîne une inhibition du comportement exploratoire et donc de la locomotion totale. L'exposition répétée à la drogue entraîne une tolérance, c.-à-d. qu'il faut une quantité plus importante pour obtenir un effet donné [222]. En revanche, dans un environnement connu, et non anxiogène, la nicotine entraîne un accroissement de la locomotion globale [176,20]. L'exposition répétée à la drogue entraîne une sensibilisation, c.-à-d. qu'une injection donnée de nicotine provoquera un accroissement plus important de locomotion.

Ce renforcement locomoteur passe par le système dopaminergique mésostrié [54,264,190]. D'autres agonistes nicotiniques montrent le même type d'effet [226,227,228,311]

13.2 Matériel et méthodes

13.2.1 Production des anticorps

La séquence des peptides a été choisie dans la portion variable du domaine cytoplasmique de la sous-unité $\alpha$6 de rat [Figure 10.4] afin d'obtenir une bonne spécificité des antisera. Cette séquence est HKSSEIAPGKRLSQQPAQWV, commençant à l'acide-aminé 399 de la pré-protéine.

Synthèse et couplage: Après la synthèse (Production pastorienne), le peptide a été couplé à de la thyroglobuline bovine (TG, Sigma T1001). Pour deux lapins, 33 mg de TG sont dissous dans 2 ml de PBS, et filtrés. 3 mg de peptide sont ajoutés. A 4 °C, 2,5 ml de glutaraldéhyde 0,2 % est ajouté goutte à goutte durant une période de 20 min. La réaction est stoppée en ajoutant 150 ml de borohydrure de sodium à 12,5 mg·ml^-1. La solution obtenue est alors dialysée une nuit contre du PBS.

Immunisation: L'immunisation des lapins a été réalisée par la société Eurogentec (Belgique). Chaque lapin reçoit une injection de 1 ml de peptide conjugué, puis, à 15 jours d'intervalle, trois autres injections de 0,5 ml.

Purification: Les anticorps ont été purifiés sur colonnes d'affinité. Le peptide est couplé à un ester d'agarose actif, Affi-Gel 10 (BIO-RAD 1536099, CA, USA) dans du MOPS 10 mM à pH7 (30 mg de peptide pour 1 ml d'Affi-Gel). La réaction est stoppée par ajout de 100 ml d'éthanolamine 1 M à pH8. Après filtration et ajout d'anti-protéases, les échantillons sont passés sur la colonne plusieurs fois. Les anticorps se fixent alors sur la colonne. Après quatre lavages successifs:

• TBS: Tris 50 mM, NaCl 150 mM, azide de sodium 0,02 % plus Tween20 0,1 %
• BBS: Borate de sodium 25 mM, acide borique 25 mM
• ACS: Acétate de sodium 50 mM
• TBS sans tween

les anticorps sont élués avec du MgCl2 4,6 M à pH65. Ils sont dialysés contre de l'hepes 10 mM, NaCl 150 mM, pH7,6 concentrés et conservés à -20 °C dans du glycérol 50 %.

13.2.2 Western-Blot

Les tissus sont homogénéisés à 10 % (masse à volume) dans le tampon:

• Tris-HCl 50 mM pH6.8
• 100 mM DTT
• 2 % SDS
• 0,1 % pyronine Y
• 10 % glycérol

L'électrophorèse et le transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose (ECL, Amersham) sont réalisés avec un appareillage mini-protean (BIO-RAD). La membrane est incubée 30 min dans du Tris sodium triton (TNT) avec 5 % de lait en poudre, puis durant la nuit dans le même tampon auquel on a ajouté le premier anticorps (3 µg/ml). On la lave trois fois dix minutes dans du TNT, puis on l'incube 1 heure dans du TNT auquel on a ajouté un anticorps anti-lapin biotinylé (Amersham RPN 1004, 1/500). On la lave trois fois dans du TNT, puis on l'incube 1 heure dans du TNT auquel on a ajouté un complexe de streptavidine-peroxydase de raifort (Amersham RPN 1051, 1/250). On lave finalement la membrane trois fois 10 min dans du TNT, et deux fois dans de l'eau (ces derniers lavage doivent être longs). Le marquage est alors révélé par le système ECL (Amersham 2106) qui produit de la chemi-luminescence avec la peroxydase. Cette chemi-luminescence peut imprimer un film autoradiographique. L'intensité des bandes est mesurée avec un analyseur d'image.

13.2.3 Oligo-désoxynucléotides utilisés

Les ODNs ont été choisis par Emilio MERLO-PICH (glaxo-welcome) selon les critères classiques pour les expériences d'antisens (voir dans [81]). Quatre ODNs antisens et deux ODNs nonsens ont été sélectionnés dont la moitié ont passé les premiers tests avec succès [Table 13.1]. Ils sont complémentaires de la partie 5' de l'ARNm codant la sous-unité $\alpha$6 (avant le site d'initiation de la traduction) ou complémentaires de la partie 3' du messager. Dans le premier cas, ils vont gêner la fixation du ribosome et donc empêcher la traduction. Dans le second cas, ils peuvent déstabiliser les structure secondaires qui, en 3', sont responsables de la résistance du messager à la dégradation. Dans les deux cas, les hybrides ARN/ADN formés sont sensibles à la RNAse H et peuvent de ce fait provoquer la dégradation du messager.

   

Tableau 13.1: Oligonucléotides utilisés dans les expériences d'inhibition par antisens. Les nucléotides en gras sont des phosphorothioates. Toutes les expériences in vitro ont été conduites à l'aide d'ODNs possédant trois nucléotides modifiés à chaque extrémité. A cause de la toxicité observée durant les expériences pilotes in vivo, les ODNs utilisés in fine ne possèdent que quatre nucléotides modifiés à l'extrémité 3'.

code et position	séquence	position relative à l'AUG
AS3 (in vitro)	5'-GCCAACTCAAAGTGCACC-3'	+179
AS4 (in vitro)	5'-TGTGGAAACCGAAGCTGT-3'	-56
AS4 (in vivo)	5'-TGTGGAAACCGAAGCTGT-3'	-56
NS2(in vivo)	5'-TACTCGCGGCGCGAAAAG-3'	nonsens

13.2.4 Préparation des cultures de cellules

Une mono-couche de cellules gliales est préparée à partir de cerveau de rat postnatal (P0-2). Le cerveau est enlevé de la cavité crânienne dans de l'HBSS (Gibco 24020-091), les voiles méningés sont enlevés soigneusement et la région mésencéphalique ventrale est disséquée (Un cerveau fourni environ 2 millions de cellules). Après trituration, le tissu est incubé 30 min dans de l'HBSS contenant 0,025 % de trypsine (plus de l'EDTA) à 37 °C. La réaction est stoppée en ajoutant 1 volume de Plating medium (PM)

• DMEM Gibco 31885-023
• 10 % de sérum de veau fœtal
• 10 % de sérum de cheval

et un volume de sérum de veau fœtal. Le tissu est alors dissocié par une série de va-et-vient dans une pipette pasteur. Après une centrifugation de 2 min à 200 G, le surnageant est ôté, 2 ml de PM ajoutés et les cellules sont doucement passées à travers une pipette Pasteur rodée jusqu'à ce que la turbidité soit homogène. Le mélange est alors filtré avec un cell strainer (Gibco) de 70 µm. Après un autre cycle centrifugation-homogénéisation-filtration, les cellules sont diluées à 100000 cellules par ml de PM et deux ml sont déposés dans des boites de culture (Nunc), lesquelles ont été préalablement incubées dans de la poly-ornithine 5 µg/ml. Le jour suivant, le milieu est enlevé, et remplacé, après lavage avec du PM frais, par du Feeding medium (FM)

• DMEM Gibco 31885-023
• 5 % de sérum de cheval

Tous les deux jours, le milieu est changé, ce qui augmente le rapport des population gliale/population neuronale. Progressivement, la glie devient confluente et forme une mono-couche uniforme.

Une semaine après, la partie ventrale du mésencéphale d'embryons de quinze jours est disséquée selon la méthode exposée ci-dessus. Les cellules sont préparées et déposées sur la mono-couche gliale. Les neurones se différencient en deux jours (sept jours sans la couche gliale). Après quatre jours, le FM est enlevé et remplacé par du DMEM additionné de supplément N2, de fibronectine, avec ou sans ODNs. A intervalle de deux jours, la moitié du milieu est changée.

13.2.5 Administration des oligonucléotides in vivo

Les expériences in vivo ont été effectuées sur des rats Sprague-Dawley mâles de 200 g. Les oligonucléotides sont dilués dans de l'eau stérile à 2,5µg·µl^-1. L'infusion est réalisée à l'aide de mini-pompes osmotiques (Alzet modèle 2001) à la vitesse de 1 µl/h durant sept jours. Les mini-pompes sont placées sous la peau du dos des animaux et liées à une canule d'injection intra-ventriculaire (Alzet brain infusion kit) comme indiqué sur la Figure 13.1.

  

Figure 13.1 : Schéma de l'implantation de l'appareillage d'infusion des oligonucléotides antisens in vivo

Les canules sont placées dans le ventricule latéral aux coordonnées stéréotaxiques latéral 1,9 mm, caudale 1,2 mm par rapport au Bregma, profondeur 3,5 mm et maintenues sur le crâne par de la colle cyanacrylate et du ciment dentaire (SS White). Durant la chirurgie les animaux sont anesthésiés avec du pentobarbital de sodium.

13.2.6 Étude du comportement locomoteur

Les mouvements dans les cages transparentes sont détectés par des faisceaux infra-rouges. Chaque rupture de faisceau incrémente le compteur associé. Après une heure d'habituation (novelty period, N), les animaux reçoivent une injection intra-péritonéale^13.1 de (-)-nicotine bi-tartrate (Sigma) de concentration variable (0,6 mg·kg^-1  pour les expériences avec ODNs) ou de solution physiologique. On laisse les animaux dans les cages une heure après l'injection (habituated period, H).

L'effet d'accroissement de la locomotion est estimé par le rapport H/N. Pour les expériences avec oligonucléotides, on utilise la formule normalisée:

où les valeurs X_s se rapportent aux animaux non-traités (sans mini-pompe) auxquels on a injecté de la solution physiologique et les valeurs X_n se rapportent aux animaux non-traités (sans mini-pompe) auxquels on a injecté 0,6 mg·kg^-1 de nicotine bi-tartrate.

13.3 Résultats

13.3.1 Traitements in vitro

Les traitements des neurones fœtaux mésencéphaliques par l'un des ODNs antisens (AS4) provoquent une diminution significative de la quantité de protéine $\alpha$6 mesurée par western-blot. Le traitement par AS3, comme le traitement par l'ODN nonsens, ne montre aucune différence significative avec les contrôles non-traités [Figure 13.2].

  

Figure 13.2: Effet des ODNs sens et antisens sur l'expression d'$\alpha$6 dans des cultures de neurones mésencéphaliques. Les valeurs sont exprimées en pourcentage du contrôle au jour2 (±SD). Jour2 et jour4 se réfèrent au traitement par ODNs, non aux jours de culture. L'étoile signifie p<0,05 avec une ANOVA (comparaison par rapport au contrôle).

L'effet d'AS4 est dose-dépendant [Figure 13.3].

  

Figure 13.3 : Effet de différentes concentrations d'ODNS antisens sur l'expression d'$\alpha$6 dans des cultures de neurones mésencéphaliques. Les valeurs sont exprimées en pourcentage de la valeur obtenue avec 0,5 µM d'AS4 (±SD). Une étoile signifie p<0,05 et deux étoiles p<0,01 avec une ANOVA (comparaison par rapport au traitement AS4 0,5 µM).

13.3.2 Traitements in vivo

Les premiers oligonucléotides utilisés possédaient six nucléotides phosphorothioates (trois en 5' et trois en 3'). La concentration utilisée était 10 µg·µl^-1. Ces traitements se sont révélés très délétères. Alors que les rats implantés avec une pompe emplie d'eau récupèrent bien de l'opération, les rats recevant des ODNs, antisens comme nonsens, perdent du poids jusqu'à atteindre un état cachectique. La mesure de la masse de nourriture absorbée montre que ces animaux ne s'alimentent plus (en revanche, la mesure du liquide absorbé montre qu'ils s'abreuvent normalement). Dans une seconde phase, nous avons diminué le nombre de liaisons phosphorothioates, n'en conservant que quatre en 3', qui est la position clé pour la résistance aux exonucléases. Nous avons également divisé la concentration des ODNs par quatre, passant ainsi à 2,5 µg·µl^-1.

13.3.3 Comportement locomoteur

Afin de déterminer si les infusions d'ODNs ont un effet sur l'activité de la voie dopaminergique, j'ai mesuré les accroissements de locomotion induits par la nicotine chez les rats habitués à leur environnement.

13.3.3.1 Courbe dose-réponse de l'effet de la nicotine sur la locomotion du rat en milieu familier

Un rat placé dans une nouvelle cage présente une activité locomotrice élevée, surtout due au comportement exploratoire (novelty period, N). Cette activité décroît de manière exponentielle au fur et à mesure que l'animal s'habitue à son nouvel environnement. Après une heure, un état de repos est atteint (habituated period, H). Si l'on injecte de la (-)-nicotine à l'animal durant l'habituated period, il va présenter un accroissement brusque de locomotion dû au stress suivi par une activité soutenue durant à peu près une heure. Les animaux injectés avec de la solution physiologique présentent la locomotion induite par le stress sans l'activité soutenue subséquente. Cet effet dépend de la dose de nicotine injectée avec un EC₅₀ d'à peu près 0,5 mg·kg^-1 (-)-nicotine bi-tartrate [Figure 13.4].

  

Figure 13.4 : Effet de la dose de nicotine injectée sur la locomotion en habituated period.

13.3.3.2 Effet de l'inhibition de l'expression d'$\alpha$6 sur la locomotion induite par la nicotine

Au septième jour d'infusion des ODNs, les rats sont placés dans les cages transparentes. Aucune différence significative n'est mesurée durant la novelty period entre les rats infusés par les antisens, les nonsens et les rats opérés sans infusion. Les animaux infusés avec les ODNs antisens ne montrent qu'un faible accroissement de l'activité durant l'habituated period quand je leur injecte 0,6 mg·kg^-1 de (-)-nicotine bitartrate [Figure 13.5].

  

Figure 13.5 : Effet normalisé de l'inhibition de l'expression d'$\alpha$6 sur la locomotion induite par la nicotine. Cette figure présente la diminution de l'effet de la nicotine, normalisée par rapport à des rats non traités par les antisens, recevant une injection i.p. de nicotine 0,6 mg·kg^-1 ou bien de la solution physiologique.

En revanche, les animaux infusés avec les ODNs nonsens ou de l'eau ne présentent aucune différence dans leur réponse comportementale à la nicotine et aucune différence significative avec les animaux non-infusés traités avec la nicotine. La différence entre les rats infusés par les ODNs antisens et nonsens est clairement significative (ANOVA une voie, p<0,01). L'effet est particulièrement clair quand les résultats sont normalisés, exprimés comme une modification de l'effet de la nicotine. Le traitement supprime 70 % de l'effet de la nicotine. Si la locomotion est suivie à intervalles de 5 min, on peut voir que l'activité est réduite alors que l'activité induite par le stress ne change pas [Figure 13.6].

  

Figure 13.6 : Effet de l'inhibition de l'expression d'$\alpha$6 sur le décours de l'effet locomoteur de la nicotine. Le graphe montre l'état d'activation de rats traités par des ODNs antisens, nonsens et non traités. Le pas d'intégration est de 5 min.

Footnotes

... intra-péritonéale^13.1

L'injection sous-cutanée au niveau de la nuque est préférable car l'effet est plus rapide et il y a moins d'échecs dus à une absorption par les organes digestifs (par exemple une injection dans l'intestin). Cependant la position de la mini-pompe osmotique rend difficile une injection à cet endroit.