9. Histoire évolutive des sous-unités du nAChR

[LE NOVÈRE N, CHANGEUX JP (1995). Molecular evolution of the nicotinic acetylcholine receptor subunit family: an example of multigene family in excitable cells. Journal of Molecular Evolution, 40 : 155-172 ]

9.1 Le nAChR dans le règne animal

Le nAChR est présent à travers tout le phylum des Bilateria, des nématodes aux humains [128,76,107,189]. De nombreuses sous-unités de nAChR neuronal ont été clonées chez les invertébrés (insectes et nématodes en particulier) [142,107]. Dans le système nerveux des insectes, l'ACh est le neurotransmetteur principal, au contraire des vertébrés, ou le glutamate prédomine. À la jonction neuro-musculaire, le glutamate est le neurotransmetteur excitateur chez les arthropodes, alors que c'est l'ACh chez les vertébrés. Puisque certaines données suggèrent que le nAChR est aussi responsable de la transmission neuro-musculaire chez les nématodes, les mollusques et les annélides [128,298,337] il est intéressant de savoir si la forme originelle du nAChR est apparue dans le muscle ou dans les neurones.

Les nAChRs neuronaux sont un bon exemple de famille multigénique exprimée de manière différentielle dans le système nerveux. Son évolution nécessite une comparaison avec l'accroissement de complexité du système nerveux des vertébrés et, en particulier, des systèmes cholinergiques.

Quelques dendrogrammes partiels avaient déjà été construits mais sans comparaison de méthodes et sans support statistique [37,60]. En parallèle à notre travail initial, Ortells et Lunt [244] présentaient une phylogénie de la superfamille fondée sur une approche probabiliste (le maximum de vraisemblance). Leurs résultats bruts étaient absolument identiques aux nôtres. Ici je présente une étude plus large de phylogenèse moléculaire embrassant la quasi-totalité de la famille des gènes de nAChR connus actuellement.

9.2 Matériel et méthodes

Les programmes décrits dans cette étude ont été utilisés sur un ordinateur Sun et un DEC. Les séquences sont celles de la Ligand Gated Ion Channel Database, voir le chapitre 8 et le tableau 9.1.  

Tableau 9.1: Gènes utilisés dans cette étude. Les abréviations sont celles utilisées dans le texte et les figures (ce sont les codes de la Ligand Gated Ion Channel Database auxquels on a ôté les trois premières lettres, marquant la famille). La première lettre représente l'identité, «le type» de la sous-unité, suivie du code de l'espèce en indice. La sous-unité $\alpha$4 de rat utilisée est l'isoforme 4-2.

Gène	espèce	Code GenEMBL	Référence
$\alpha$1bt	Bos taurus	X02509	Noda et al. Nature 305:818 (1983)
$\alpha$3bt	Bos taurus	X57032	Criado M et al. Neurochem Res 17:281 (1992)
$\alpha$7bt	Bos taurus	X93604	Garcia-Guzman et al. Eur J Neurosci 7:647 (1995)
$\beta$1bt	Bos taurus	X00962	Tanabe et al. Eur J Biochem 144:11 (1984)
$\delta$bt	Bos taurus	X02473	Kubo et al. Eur J Biochem 149:5 (1985)
$\epsilon$bt	Bos taurus	X02597	Takai et al. Nature 315:761 (1985)
$\gamma$bt	Bos taurus	M28307	Takai et al. Eur J Biochem 143:109 (1984)
$\alpha$3ca	Carassius auratus	X54051	Hieber et al. NAR 18:5293(1990)
$\beta$2ca	Carassius auratus	X54052	Hieber et al. NAR 18:5307 (1990)
n$\alpha$2ca	Carassius auratus	X14786	Cauley et al. J Cell Biol 108:637 (1989)
n$\alpha$3ca	Carassius auratus	M29529	Cauley et al. J Neurosci 10:670 (1990)
$\alpha$1ce	Cænorhabditis elegans	X83887	Ballivet et al. J Mol Biol 258:261 (1996)
ACR2ce	Cænorhabditis elegans	X86403	Squire et al. Recept Channels 3:107 (1995)
ACR3ce	Cænorhabditis elegans	Y08637	Baylis et al. Rec Chan 5:149 (1997)
DEG3ce	Cænorhabditis elegans	U19747	Treinin and Chalfie. Neuron 14: 871 (1995)
LEV1ce	Cænorhabditis elegans	X98601	Fleming et al. J Neurosci 17:5843(1997)
UNC29ce	Cænorhabditis elegans	U81144	Flemming et al. J Neurosci 17:5843(1997)
			Ballivet et al. J Mol Biol 258:261 (1996)
UNC38ce	Cænorhabditis elegans	X98600	Flemming et al. J Neurosci 17:5843(1997)
F18G5ce	Cænorhabditis elegans	U39855	Wilson et al. Nature 368:32 (1994)
R01E6ce	Cænorhabditis elegans	Z68118	Wilson et al. Nature 368:32 (1994)
T05C12ce	Cænorhabditis elegans	Z66500	Wilson et al. Nature 368:32 (1994)
T09A5ce	Cænorhabditis elegans	Z36753	Wilson et al. Nature 368:32 (1994)
ZC504ce	Cænorhabditis elegans	Z50029	Wilson et al. Nature 368:32 (1994)
ALSdm	Drosophila melanogaster	X07194	Bossy et al. EMBO J 7:611 (1988)
SADdm	Drosophila melanogaster	X53583	Sawruk et al. EMBO J 9:2671 (1990)
SBDdm	Drosophila melanogaster	X55676	Sawruk et al. FEBS Lett 273:177 (1990)
ARDdm	Drosophila melanogaster	X04016	Hermans-Borgmeyer et al. EMBO J 5:1503 (1986)
$\alpha$2gg	Gallus gallus	M07339-44	Nef et al. EMBO J 7:595 (1988)
$\alpha$3gg	Gallus gallus	M37336	Couturier et al. JBC 265:17560 (1990)
$\alpha$4gg	Gallus gallus	X07348-53,99	Nef et al. EMBO J 7:595 (1988)
$\alpha$5gg	Gallus gallus	J05642	Couturier et al. JBC 265:17560 (1990)
$\alpha$6gg	Gallus gallus	X83889	Alliod and Ballivet unpublished (1995)
$\alpha$7gg	Gallus gallus	X68586	Couturier et al. Neuron 5:847 (1990)
$\alpha$8gg	Gallus gallus	X52296	Schoepfer et al. Neuron 5:35 (1990)
$\beta$2gg	Gallus gallus	X53092	Schoepfer et al. Neuron 1:241 (1988)
$\beta$3gg	Gallus gallus	X83889	Alliod and Ballivet unpublished (1995)
$\beta$4gg	Gallus gallus	J05643	Couturier et al. JBC 265:17560 (1990)
$\delta$gg	Gallus gallus	K02903	Nef et al. PNAS 81:7975 (1984)
$\gamma$gg	Gallus gallus	K02904	Nef et al. PNAS 81:7975 (1984)
$\alpha$1hs	Homo sapiens	Y00762	Schoepfer et al. FEBS Lett 226:235 (1988)
$\alpha$2hs	Homo sapiens	U62431	Elliott et al. J Mol Neuro 7:217 (1996)
$\alpha$3hs	Homo sapiens	M37981	Mihovilovic et al. J Exp Neurol 111:175 (1991)
$\alpha$4hs	Homo sapiens	X87629	Mamalaki et al. unpublished (1995)
$\alpha$5hs	Homo sapiens	M83712	Chini et al. PNAS 89:1572 (1992)
$\alpha$6hs	Homo sapiens	U62435	Elliott et al. J Mol Neuro 7:217 (1996)
$\alpha$7hs	Homo sapiens	X70297	Peng et al. Mol Pharmacol 45:546 (1994)
$\beta$1hs	Homo sapiens	X14830	Beeson et al. NAR 17:4391 (1989)
$\beta$2hs	Homo sapiens	X53179	Anand et al. NAR 18:4272 (1990)
$\beta$3hs	Homo sapiens		Willoughby et al. Neurosci Lett 155:136 (1993)
$\beta$4hs	Homo sapiens	X68275	Tarroni et al. FEBS Lett 312:66 (1992)
$\delta$hs	Homo sapiens	X55019	Luther et al. J Neurosci 9:1082 (1989)
$\epsilon$hs	Homo sapiens	X66403	Beeson et al. unpublished
ALSms	Manduca sexta	Y09795	Eastham et al. Eur J Neurosci 10: 879 (1998)
5-HT3mm	Mus musculus	M74425	Maricq et al. Science 254:432 (1991)
$\alpha$1mm	Mus musculus	M17640	Boulter et al. J Neurosci 5:2545 (1985)
$\alpha$6mm	Mus musculus
$\beta$1mm	Mus musculus	M14537	Buonanno et al. J Biol Chem 261:16451 (1986)
$\gamma$mm	Mus musculus	M30514	Boulter et al. J Neurosci Res 16:37 (1986)
$\delta$mm	Mus musculus	L10076	Boulter unpublished (1993)
$\epsilon$mm	Mus musculus	X55718	Gardner. NAR 18:6714 (1990)
Rov	Onchocerca volvulus	L20465	Ajuh and Egwang. Gene 144:127 (1994)
$\alpha$2rn	Rattus norvegicus	L10077	Wada et al. Science 240:330 (1988)
$\alpha$3rn	Rattus norvegicus	X03440	Boulter et al. Nature 319:368 (1986)
$\alpha$4rn	Rattus norvegicus	M15681-82	Goldman et al. Cell 48:965 (1987)
$\alpha$5rn	Rattus norvegicus	J05231	Boulter et al. J Biol Chem 265:4472 (1990)
$\alpha$6rn	Rattus norvegicus	L08227	Boulter unpublished (1988)
$\alpha$7rr	Rattus rattus	M85273	Séguéla et al. J Neurosci 13:596 (1993)
$\alpha$9rr	Rattus rattus	U12336	Elgoyhen et al. Cell 79:705 (1994)
$\beta$2rn	Rattus norvegicusÂ		Deneris et al. Neuron 1:45 (1988)
$\beta$3rn	Rattus norvegicus	J04636	Deneris et al. J Biol Chem 264:6268 (1989)
$\beta$4rn	Rattus norvegicus	J05232,M89971, M33951-3,M89989	Boulter et al. J Biol Chem 265:4472 (1990)
$\delta$rr	Rattus rattus	X74835	Witzemann et al. Eur J Biochem 194:437 (1990)
$\epsilon$rr	Rattus rattus	X13252	Criado et al. NAR 16:10920 (1988)
$\gamma$rr	Rattus rattus	X74834	Witzemann et al. Eur J Biochem 194:437 (1990)
GLY$\alpha$3rn	Rattus norvegicus	M55250	Kuhse et al. J Biol Chem 265:22317 (1990)
GABA$\alpha$1rr	Rattus rattus	L08490	Seeburg et al. CSH Symp Quant Biol 55:29 (1990)
$\alpha$L1sg	Schistocerca gregaria	X55439	Marshall et al. EMBO J 9:4391 (1991)
$\alpha$1tc	Torpedo californica	J00963	Noda et al. Nature 299:793 (1982)
$\beta$1tc	Torpedo californica	J00964	Noda et al. Nature 301:251 (1983)
$\delta$tc	Torpedo californica	J00965	Noda et al. Nature 301:251 (1983)
$\gamma$tc	Torpedo californica	J00966	Ballivet et al. PNAS 79:4466 (1982)
TAR1tsc	Trichostrongylus colubriformis	U56903	Wiley et al. gene 182:97 (1996)
$\alpha$1axl	Xenopus laevis	X17244	Hartman et al. Nature 343:372 (1990)
$\alpha$1bxl	Xenopus laevis	X07067	Baldwin et al. J Cell Biol. 106:469 (1988)
$\beta$1xl	Xenopus laevis	U04618	Kullberg et al. Rec Chan (1994) in press
$\delta$xl	Xenopus laevis	X07069	Baldwin et al. J Cell Biol. 106:469 (1988)
$\epsilon$xl	Xenopus laevis	U19612	Murray et al. Neuron (1995)
$\gamma$xl	Xenopus laevis	X07068	Baldwin et al. J Cell Biol. 106:469 (1988)

9.2.1 Alignements des séquences

J'ai réalisé les alignements de séquences avec les programmes CLUSTALV et CLUSTALW [156,317]. Ces programmes comparent les séquences deux à deux selon la méthode de Wilbur et Lipman [350] (gap penalty=3) et construisent un arbre préliminaire par la méthode non pondérée de l'UPGMA [306] pour CLUSTALV et par le Neighbor-Joining (NJ) [286] pour CLUSTALW. Puis les programmes alignent toutes les séquences par ordre de similarité décroissante comme Feng et Doolittle [104] (Coût de création de Gap=5, coût de continuation=0,5, série de matrice Blosum [152] ). L'utilisation de différentes valeurs de coût de Gap ne change ni la topologie ni les rapports de longueur de branche mais résulte en une transformation homothétique des arbres. Avant analyse, j'ai modifié les alignements comme suit :

1.

Délétion du peptide signal (correspondant aux acides aminés 1 à 27 de $\alpha$1)

2.

Délétion de la partie non-conservée du domaine amino-terminal, entre les composants B et F du site de liaison de l'ACh (correspondant à l'acide aminé R188 de $\alpha$1_tc)

3.

Délétion de la partie hautement variable du domaine cytoplasmique (correspondant aux acides aminés 356 à 393 de $\alpha$1_tc)

4.

Délétion de la partie carboxy-terminale (correspondant aux acide aminés 452 à 461 de $\alpha$1_tc)

En sus, pour déterminer le branchement de la séquence de nématode R_ov, une délétion additionnelle correspondant aux 38 acides aminés amino-terminaux de $\alpha$8_gg a été réalisée sur 12 séquences.

   

Tableau 9.2: Caractéristiques des alignements utilisés

Nombre de séquences	longueur de l'alignement	sites informatifs
83	393	357
12	402	296
12	351	263

9.2.2 Analyses des séquences

J'ai obtenu les inférences sur l'évolution des gènes avec la suite PHYLIP 3.5c de Joe FELSENSTEIN [103]. La méthode cladistique est le maximum de parcimonie (MP) [106] (programme PROTPARS). Les sous-unités 5-HT₃ de souris et glycine$\alpha$3 de rat ont servi de groupe externe. L'utilisation de la sous-unité GABA $\alpha$1 de rat à la place de glycine $\alpha$3 ne change pas les résultats. La méthode phénétique est le Neighbor-Joining (NJ) [286] (programme NEIGHBOR). Les distances ont été déterminées à l'aide de la matrice PAM250 [79] (programme PROTDIST). Un ré-échantillonnage avec remise (de type bootstrap [102]) a été utilisé pour déterminer la force des branches (programmes SEQBOOT, seed: 5, 1000 répliquats et CONSENSE).

9.2.3 Analyse de la structure des gènes

On peut analyser la structure des gènes en considérant la position des introns comme des caractères binaires (présence ou absence). Pour cela j'ai utilisé un algorithme de parcimonie dit de Wagner [92] (programme MIX) et la compatibilité [186,100] (programme CLIQUE).

  
9.2.4 Détermination des dates de divergence

La détermination des dates approximatives de divergence entre sous-unités [Figure 9.5] est basée sur l'analyse par NJ de l'alignement de 83 séquences décrit dans le Tableau 9.2. Les branches externes de l'arbre en résultant présentent des taux d'évolution relativement constants pour chaque sous-groupe. On dit qu'il y a horloge moléculaire. Par exemple, chaque branche externe du sous-groupe des sous-unités musculaires $\delta$, $\epsilon$, $\gamma$  présente un taux d'évolution estimé compris entre 0,32 x 10^-9  et 0,73 x 10^-9 substitutions par site et par an ( $\bar{r}=5,3; \sigma=1,2$). On peut donc déterminer les dates des dernières duplications. Cependant les taux d'évolution varient beaucoup entre sous-groupes, et les duplications précoces ne peuvent être calculées par cette méthode. Afin de déterminer la date de divergence entre deux sous-unités paralogues, on détermine les taux d'évolution locaux à partir des orthologues connus. Dans l'exemple décrit sur la figure 9.1, $r_i=\frac{l_1+l_2}{2t_1}$ et $r_j=\frac{l_3+l_4}{2t_2}$. On peut alors extrapoler ces taux d'évolution aux branches voisines, ici l₅ et l₆ pour déterminer la durée écoulée depuis un noeud donné.

$$t_x=\frac{1}{2}(\frac{2l_5+l_1+l_2}{2r_i}+\frac{2l_6+l_3+l_4}{2r_j})$$

  

Figure 9.1 : Détermination de la date de divergence entre paralogues à partir des orthologues connus

Les dates de calibrage utilisées [19,115] sont:

• Torpedo / osteichthia : 450 MYA
• Carassius (poisson rouge) / tétrapodes : 405 MYA
• Xenopus / Amniotes : 365 MYA
• Gallus / mammifères : 310 MYA
• Mus / Homo : 110 MYA
• Bos / Homo : 70 MYA
• Mus / Rattus : 38 MYA

9.3 Résultats

9.3.1 Analyses de séquences

Les analyses de séquence révèlent l'existence de plusieurs sous-familles de sous-unités du nAChR [figures 9.2]. On obtient les divergences successives des sous-familles I, puis II et enfin III et IV.

Les sous-unités de protostomiens homologues des sous-familles III et IV apparaissent polyphylétiques. Cependant ces positions sont supportées par des scores de bootstrap très faibles. ALS de drosophile et de Manduca sont probablement orthologues, et l'arbre réel est [(SAD d'insecte, ALS d'insecte), $\beta$2 de drosophile]. UNC38 de Cænorhabditis, TAR1 de Trichostrongylus et la sous-unité d'Onchocerca pourraient être orthologues, fait qui expliquerait l'impossibilité de les ordonner.

Les deux groupements $\beta$2 et $\beta$4 avec la sous-famille IV et $\alpha$1 avec la sous-famille III sont faiblement supportés par les scores de bootstrap. La position de ces sous-unités est instable, sautant entre les sous-familles. Cette position pourrait être un artefact résultant de l'apparition précoce et du faible taux de divergence de ces sous-unités. Les taux d'évolution de $\alpha$1, $\beta$2 et $\beta$4, nettement plus faibles que ceux des autres sous-unités, impliquent qu'on ne peut réellement avoir confiance dans les branches reconstruites. De plus, la structure des gènes codant $\beta$2 et $\beta$4 est exactement identique à celle des gènes codant $\alpha$2-6 et $\beta$3 et très différente des gènes codant les sous-unités non-$\alpha$ musculaires. Ceci est en faveur d'une clade contenant toutes les sous-unités du nAChR neuronal hétéro-oligomérique, ainsi que la localisation neuronale et les caractéristiques pharmacologiques des récepteurs contenant ces sous-unités.

  

Figure 9.2 : Dendrogramme résumant les analyses de séquence.
Entre parenthèse se trouve le nombre d'orthologues réellement analysées représentées par la branche terminale. Au-dessus des branches se trouvent les scores de bootstrap du maximum de parcimonie (arrondis au plus proche entier). Au-dessous des branches se trouvent les scores de bootstrap du neighbor-joining.
Les triplications dénotent une incertitude, c.-à-d. une opposition totale des méthodes (comme pour unc38, tar1 et la sous-unité d'Onchocerca), ou bien les deux méthode procurant des scores de bootstrap inférieurs à 50 % (comme pour les sous-unités hétéro-oligomériques de vertébrés et les deux grands groupes de sous-unités de protostomiens).
Les encadrés dénotent des branches faiblement supportées par les deux scores inférieur à 90 %. Les petites étoiles signifient que ce branchement était absent dans l'analyse considérée (mais le nœud représenté était supporté par un score supérieur à 50 % par l'autre méthode).
Les grosses étoiles noires marquent la divergence protostomiens/deuterostomiens et les gros cercles noirs marquent la divergence nématodes/insectes.

Dans la sous-famille IV, la sous-unité $\beta$1 diverge la première, suivie par la sous-unité $\delta$. Un duplication subséquente donne les sous-unités $\gamma$ et $\epsilon$. Le branchement de $\gamma$ de torpille et d'$\epsilon$ de Xenopus comme groupe frère des $\epsilon$ de mammifères pourrait signifier que «$\gamma$» de torpille est en fait «$\epsilon$», et donc que cette duplication aurait eu lieu peu avant la divergence des sous-unités de torpille (c.-à-d. avant la divergence de la lignée des elasmobranchia) avec une disparition subséquente de $\gamma$ dans la lignée des elasmobranchia. Au contraire ce groupement pourrait signifier que la duplication aurait eu lieu si peu de temps après la divergence des sous-unités de torpille que la branche conduisant du nœud chondrichthia / osteichthia au nœud $\gamma$/$\epsilon$ a une longueur nulle. $\gamma$ «saute» alors d'une branche à l'autre.

Dans la sous-famille III, plusieurs groupements sont présents dans plus de 99% des essais: ($\beta$2, $\beta$4), ($\beta$3, $\alpha$5), ($\alpha$2, $\alpha$4), ($\alpha$3, $\alpha$6). Une première duplication a donné $\beta$2 et $\beta$4. Ensuite, on observe la séparation de $\beta$3 et $\alpha$5. Enfin, un groupe monophylétique formé des deux paires ($\alpha$4, $\alpha$2) et ($\alpha$3, $\alpha$6) est présent dans les analyses par MP et NJ. Les dernières duplications claires ont lieu dans la lignée des téléostéens, qui possèdent deux homologues de $\beta$3 (apparus il y a a peu près 280 MYA), et chez les tétrapodes qui ont deux homologues du $\beta$2 de poisson rouge, les sous-unités $\beta$2 et $\beta$4. De plus, la sous-unité $\alpha$3 du poisson rouge n'est pas clairement homologue de $\alpha$3 ou $\alpha$6 des tétrapodes, qui pourraient donc être apparue après la divergence des téléostéens.

9.3.2 Évolution de la structure des gènes

Le nombre d'exons identifiés dans les gènes des sous-unités du nAChR varie largement au sein de la famille, bien que quelques caractéristiques communes puissent être reconnues [Figure 9.3]. Quatre sous-familles peuvent être identifiées sur la base de la structure génomique, identiques à celles déjà inférées à partir des analyses de séquences. Elles sont

1.

la sous-famille des sous-unités neuronales formant des récepteurs sensibles à l'$\alpha$-bgt.

2.

une sous-famille de sous-unités neuronales d'arthropode.

3.

la sous-famille des sous-unités neuronales formant des récepteurs insensibles à l'$\alpha$-bgt

4.

la sous-famille des sous-unités du récepteur musculaire

  

Figure 9.3 : Structure des gènes des sous-unités. Seuls les exons au moins partiellement codant sont représentés. Le niveau de gris reflète grossièrement la conservation de l'exon à travers la famille (c.-à-d. la présence d'une frontière exonique à cette place exacte dans différentes sous-unités, mais non la similitude de séquence entre les exons homologues). A, B, C: composant du site de liaison. MI, MII, MIII, MIV: segments transmembranaires. PS: peptide signal. Les têtes de flèche marquent les limites informatives (dans une acception cladistique). Adapté de [166], avec l'aide d'Alain Bessis.

Les gènes de la sous-famille IV possèdent 11 ou 12 exons, parmi lesquels 10 sont conservés. Dans la sous-famille III, la majeure partie de la séquence codante est distribuée dans un seul exon. Les structures des gènes codant $\alpha$1 et $\alpha$7 diffèrent des deux «holotypes» (III ou IV). Cependant, il est difficile de déterminer si la structure de ces deux gènes est principalement plésiomorphe ou bien contient des autapomorphies. Afin d'extraire de l'information à partir de la structure génique, une analyse cladistique des frontières entre introns et exons est réalisée. Seuls dix sites informatifs ont été considérés [Figure 9.3]. Une analyse de parcimonie de caractères à deux états (c.-à-d. présence ou absence de la frontière) produit trois cladogrammes à 12 étapes (résumés sur la figure 9.4 avec un enracinement arbitraire correspondant aux analyses de séquence, voir plus bas).

  

Figure 9.4 : Cladogramme construit à partir de la structure exonique des gènes analysée par le Maximum de Parcimonie. L'arbre représenté est le consensus de trois arbre équivalents. Les limites informatives de chaque gène est codée à la droite de son nom (0: absence; 1: présence). Rectangle blanc : perte de limite ; Rectangle noire : gain de limite. Le cladogramme est arbitrairement enraciné. Les longueurs de branche n'ont aucune signification.

Une analyse de compatibilité donne les même résultats (bien que l'arbre résultant soit automatiquement enraciné à un point différent, c.-à-d. entre les gènes des sous-unités musculaires et neuronales). Une explication possible serait que la structure génique des sous-unités de type I contienne principalement des autapomorphies, alors que celle d'$\alpha$1 est plésiomorphe au sein de la sous-famille IV. Sur la base de l'analyse de la structure des gènes, cette dernière sous-unité serait un groupe frère de toutes les autres sous-unités de la sous-famille IV. Cependant, les analyses de séquence (vide infra) placent $\alpha$1 comme groupe frère de la sous-famille III. Une translocation (p.ex. entre les exons 4 et 5) pourrait masquer la position réelle de $\alpha$1. Des études ultérieures de similarité de séquence entre les exons des paralogues seront nécessaires afin d'éclaircir ce problème.

9.3.3 Évolution de la stœchiométrie

Comme le nAChR est un oligomère formé de sous-unités codées par des paralogues, il est raisonnable de supposer que le récepteur initial résultait de l'assemblage de plusieurs exemplaires d'une même sous-unité. La faculté, pour une sous-unité, de former des homo-oligomères fonctionnels pourrait donc refléter un mode de fonctionnement plésiomorphe («primitif»). Des homo-oligomères de Locusta migratoria sensibles à l'$\alpha$-bgt [36] ont été purifiés et reconstitués in vitro [146]. La sous-unité s$\alpha$L1 de Schistocerca gregaria forme des canaux homo-oligomérique fonctionnels [209] bloqués par l'$\alpha$-bgt in vitro. SAD_dm[14,291] l'homologue putatif chez la drosophile de s$\alpha$L1 de criquet, forme seule des récepteurs fonctionnels dans des ovocytes de Xenopus [291], bien que ces récepteurs présentent une pharmacologie atypique. De la même façon, $\alpha$7 et $\alpha$8 sont capables de former des homo-oligomères dans les ovocytes de Xenopus [71,265,7,8]. Au contraire, les sous-unités des nAChRs de vertébrés des sous-familles III et IV, exprimées en ovocyte de Xenopus, ne peuvent pas former de canaux homo-oligomériques.

9.3.4 Arguments pharmacologiques en faveur de la monophylie de la sous-famille des nAChRs neuronaux insensibles à l'$\alpha$-bgt

Bien qu'un petit nombre de mutations suffise parfois pour changer dramatiquement les propriétés d'un récepteur (voir p.ex. [119]), les propriétés pharmacologiques des familles de LGIC semblent diverger lentement. Les récepteurs du muscle de l'ascaris [337], de l'Aplysia [241], $\alpha$L1 (insecte classe2, [209]), ard (insecte classe1, [293]), $\alpha$7 [71,8], $\alpha$9 [98] et le muscle strié [188,44] des vertébrés sont sensibles à l'$\alpha$-bgt. La perte de sensibilité à l'$\alpha$-bgt serait donc une synapomorphie du groupe des récepteurs neuronaux hétéromériques. De plus, les récepteurs du muscle de l'Ascaris [337], des neurones de l'Aplysia [241] et le récepteur formé par s$\alpha$L1 de Schistocerca [209] sont sensibles à la strychnine, un antagoniste des récepteurs de la glycine, et à la bicuculline, un antagoniste des récepteurs GABA_A. $\alpha$7 est également sensible à la strychnine [8]. Les membres d'une famille multigénique peuvent donc partager des propriétés pharmacologiques, même après une longue divergence (bien plus de 1000 MYA). Les récepteurs de la sous-famille III ne semblent pas bloqués par la strychnine et la bicuculline. Cette insensibilité serait là encore une synapomorphie.

9.4 Discussion

Les analyses présentées ci-dessus mènent à une reconstruction de l'histoire évolutive des sous-unités du nAChR. Bien que plusieurs nœuds ne soient pas parfaitement résolus, les principales relations entre sous-unités ont été clarifiées.

9.4.1 Hypothétiques gènes manquants

Les relations évolutives entre $\alpha$9 de rat, F18G5 et deg3 de Cænorhabditis sont peu claires. Si l'arbre présenté sur la figure 3.2 représente la réalité, les homologues de F18G5 et DEG3 restent à découvrir chez les vertébrés (le contraire est également vrai). Au vu du nombre important de sous-unités de LGIC révélées par le séquençage du génome de Cænorhabditis elegans (une soixantaine, la plupart sans homologues évidents chez les vertébrés), il est probable que le séquençage à grande échelle du génome humain nous réserve bien des surprises.

La sous-famille II a divergé bien avant la séparation protostomiens /deutérostomiens comme en témoignent la présence des sous-unités de Cænorhabditis $\alpha$1, T09A5 et T05C12, orthologues de $\alpha$7 et $\alpha$8. Cette sous-famille pourrait avoir des homologues chez les insectes (Les sous-unités clonées chez les insectes sont les orthologues des sous-familles III et IV).

La sous-unité $\epsilon$ semble être présente dans l'ensemble du phylum des gnathostomata. Son existence est attestée chez les amphibiens et les mammifères. L'absence de cette sous-unité chez le poulet pourrait refléter une perte «récente».

Le bootstrap confirme que $\alpha$7 et $\alpha$8 ont divergé avant la séparation des sauropsidés et des theropsida. $\alpha$8 pourrait donc avoir disparu spécifiquement dans la lignée mammalienne.

  
9.4.2 Histoire reconstituée de la famille des sous-unités du nAChR

Sur la base des résultats présentés ici et de ceux de la littérature, on peut faire l'hypothèse d'une histoire de la famille des gènes codant les sous-unités du nAChR reconstituée comme suit (Figure 9.5) :

   Figure 9.5 : Phylogramme résumé des sous-unités d'amniote, intégrant les résultats de toutes les analyses. Les dates des dernières divergences ont été calculées (§ 9.2.4) : $\alpha$7/$\alpha$8 : 380 MYA, $\epsilon$/$\gamma$ : 508 MYA, ($\epsilon$,$\gamma$/$\delta$ : 711 MYA, ($\epsilon$,$\gamma$,$\delta$/$\beta$1 : 926 MYA, $\alpha$3/$\alpha$6 : 529 MYA, $\alpha$2/$\alpha$4 : 669 MYA, $\alpha$5/$\beta$3 : 770 MYA. La divergence entre les sous-famille III et IV peut être approximativement déduite de la divergence nématode/humain (1000 MYA : [329]). Les cadres autour des noms de sous-unité signifient qu'elles portent le composant principal du site de liaison de l'ACh. La localisation neuronale est représentée en bleu, musculaire en rouge, et épithéliale en gris. Les numéros encerclés représentent les synapomorphies caractérisant les groupes monophylétiques imbriqués:

1. Activation par l'acétylcholine
2. Activation par la nicotine
3. Hétéromérie (au moins in vivo)
4. Insensibilité à l'$\alpha$-bungarotoxine.

Cette dernière caractéristique est une mauvaise synapomorphie car elle n'est valable qu'au sein des nAChRs (p. ex. un récepteur glycine est également insensible à l'$\alpha$-bgt).

On peut supposer de manière plausible (toutefois sans preuves tangibles) que chez les métazoaires primitifs (p.ex. les cœlentérés) les nAChRs étaient fait d'une seule sous-unité répétée cinq fois. Les cœlentérés n'ont pas de vrais cellules musculaires mais ont déjà des neurones multipolaires, d'origine ectodermique. Ce premier nAChR avait une localisation présumée neuronale (ou du moins ectodermique). Une première duplication^9.1 a alors lieu, donnant naissance à l'ancêtre d'$\alpha$9 et à celui des sous-familles II,III,IV qui voit son expression restreinte aux neurones. Avec l'apparition d'un troisième feuillet embryonnaire, le nAChR a acquit un nouveau rôle dans la transmission neuro-musculaire. Une nouvelle duplication donne naissance à l'ancêtre d'$\alpha$7,8 qui reste dans les neurones et à celui des sous-familles III-IV dont l'expression devient musculaire. Enfin, après la divergence protostomiens/deuterostomiens, une duplication donne naissance à l'ancêtre de la sous-famille IV qui reste exprimé dans le muscle, et à celui de la sous-famille III dont l'expression devient neuronale.

Si l'on suppose que $\alpha$L1 de Schistocerca et SAD de la drosophile sont orthologues, la duplication entre elles et ALS de drosophile est plus ancienne que la divergence entre orthoptères et diptères, elle-même remontant à plus de 300 MYA [178].

Chez les deutérostomiens, plusieurs duplications engendrèrent la sous-famille IV existante, qui fut complète dans le phylum des vertébrés avant l'apparition des chondrichthya (450 MYA), et la sous-famille III.

On voit que l'évolution des promoteurs (et des régulateurs transcriptionnels) pourrait avoir joué un rôle aussi important que les duplications de gènes dans la diversification de la famille du nAChR.

Les sous-unités non-$\alpha$ de la sous-famille III sont probablement d'origine polyphylétique, alors que les $\alpha$ formeraient un groupe monophylétique. $\alpha$5, à laquelle manquent plusieurs acides aminés aromatiques importants dans le troisième composant du site de liaison de l'ACh(et également dans le premier pour certains orthologues), ne peut former de récepteurs fonctionnels in vitro avec aucune sous-unité $\beta$ [33] mais nécessite la présence d'une autre sous-unité $\alpha$ [262,338] (et est présente in vivo dans des oligomères contenant une autre $\alpha$ [63,330,62,297]). Elle pourrait donc représenter un nouveau type de sous-unité, fonctionnellement analogue à $\beta$1 dans le muscle.

9.4.3 Diversification de la sous-famille des sous-unités de récepteurs neuronaux hétéro-oligomériques chez les vertébrés, et accroissement de la complexité des systèmes cholinergiques

Les duplications multiples dans la sous-famille III sont parallèles à l'accroissement progressif du système nerveux des chordés, en particulier des structures cholinergiques. A l'origine de l'évolution de ce phylum, une sous-unité était probablement présente dans le système neuro-musculaire (peut-être uniquement dans le muscle) en sus de l'ancêtre commun à $\alpha$7 et $\alpha$8, ayant peut-être la faculté de former des homo-oligomères. Une première duplication a donné une sous-unité dont l'expression a été modifiée pour n'être plus exprimée que dans le système nerveux. Elle a donné naissance à la sous-famille III. La sous-unité soeur a donné naissance à la sous-famille des sous-unités du récepteur musculaire. La diversité de la sous-famille a augmenté durant les premiers 400 MYA, jusqu'à l'apparition des tétrapodes. Toute l'évolution de la sous-famille a donc pris place dans la première moitié de l'histoire des deutérostomiens (de 600-800 MYA à environ 300 MYA).

Chez les préchordés les plus «primitifs», comme les tuniciers, le système nerveux n'est généralement constitué que d'un seul ganglion central [332] avec parfois un cordon nerveux ganglionnaire. Branchiostoma (l'amphioxus) a seulement une pseudo-vésicule cérébrale suivie d'une moelle épinière [332]. La moelle épinière et le système nerveux périphérique étaient présents assez tôt dans l'évolution de la lignée des vertébrés [126,15,40]. La Lamproie a cinq vésicules cérébrales et son système nerveux sympathique contient des ganglions périphériques individualisés [40]. Le principal développement du cerveau et particulièrement du télencéphale a cependant lieu chez les gnathostomes et le système autonome cholinergique complet -- du point de vue humain -- n'est atteint que chez les mammifères.

Les études d'hybridation in situ [80,335,334,90,372,185] comme celles d'immuno-histochimie [38,157,136] ont montré que, dans le cerveau de rat et de poulet, la distribution des ARNm d'$\alpha$4 et $\beta$2 est large, alors que les sous-unités $\alpha$2, $\alpha$3, $\alpha$5, $\alpha$6, $\beta$3 et $\beta$4 sont principalement restreintes à quelques voies cholinergiques ou cholinoceptives principales (qui, en sus, expriment aussi $\alpha$4 et $\beta$2). L'ancêtre commun à $\beta$2 et $\beta$4 a divergé tôt dans l'histoire de la sous-famille [Figure 9.5]. $\alpha$4 et $\beta$2 pourraient représenter une expression «fossile», qui était présente dans la plus grande partie du cerveau ancestral. Quand une duplication de gène a lieu, un des paralogues conserve la fonction du gène «père», tandis que l'autre doit en acquérir une nouvelle. Ce rôle peut être défini par un nouveau domaine d'expression (comme les changements de spécificité muscle/neurone) ou par une fonction modifiée. L'hypothèse qu'$\alpha$4 a maintenu son rôle premier tandis que les paralogues nouvellement arrivés en ont acquis un autre est illustrée par la sous-unité $\alpha$2. Dans le cerveau de poulet, la sous-unité $\alpha$2 est restreinte au noyau spiriforme latéral [77], mais, dans le cerveau de rat, elle est restreinte au noyau interpédonculaire [335] -- une structure non-homologue (le noyau interpédonculaire existe également dans le cerveau de poulet). De plus, il n'y a pas d'homologue du noyau spiriforme dans le cerveau de rat, ce qui sous-tend l'idée d'une genèse de cette structure après la séparation des lignées aviaire et mammalienne. Il est tentant de penser qu'une duplication génique a eu lieu «peu de temps» avant le branchement théropsidés/sauropsidés (c.-à-d. avant 310 MYA, [19]). Ce laps de temps aurait été trop court pour établir une spécificité d'expression pour $\alpha$2 (au contraire d'$\alpha$4 qui conservait le rôle de l'ancêtre commun). Deux spécificités d'expression se seraient donc mise en place indépendamment dans les deux phylums. D'ailleurs, un transgène avec le gène $\alpha$2 aviaire (incluant le promoteur) est exprimé à travers tout le cerveau de souris, principalement dans les structures cholinergiques (noyaux moteurs, télencéphale basal etc.) [78]. Cependant cette distribution ne correspond ni à la distribution de la sous-unité $\alpha$2 endogène, ni à celle d'$\alpha$4.

De la même façon, les duplications $\alpha$3/$\alpha$6 et $\beta$2/$\beta$4 ont eu lieu un peu avant, ou un peu après, la séparation des lignées des téléostéens et des tétrapodes. Dans le cerveau de rat, $\alpha$3 et $\beta$4 sont fortement exprimées dans l'habénula médiale, une structure cholinergique et cholinoceptive. Cependant, chez un poisson téléostéen (Phoxinus phoxinus), une étude immuno-cytochimique n'a pas trouvé de cellules cholinergiques dans l'habénula, et seulement un petit nombre de fibres cholinergiques [97]^9.2. Si ces caractéristiques sont plésiomorphes, il pourrait y avoir là encore une corrélation entre duplication de gène et changement subséquent de fonction. $\alpha$4 et $\beta$2 pourraient avoir gardé le rôle premier du nAChR tandis que les autres paralogues auraient trouvé de nouvelles spécificités fonctionnelles dans les systèmes cholinergiques en évolution.

9.5 Conclusion

Nous avons montré, sur la base de cladogrammes et de phénogrammes, que les premières duplications dans la famille des sous-unités du nAChR ont eu lieu au tout début de l'évolution des Bilatéria, voire même avant. Plusieurs sous-familles de nAChR ont été identifiées. Il y a congruence entre les analyses de la structure des gènes et de leur séquence, et les sous-familles présentes chez les vertébrés correspondent au sous-groupes fonctionnels (décrits à partir de critères anatomiques, pharmacologiques et structuraux). Deux phénomènes semblent avoir entraîné la richesse de comportement de la famille. Tout d'abord, plusieurs changements de spécificité d'expression ont eu lieu entre différents tissus. Ensuite, de multiple duplications de gène ont donné le grand nombre de paralogues actuels. La sous-famille des sous-unités de récepteurs neuronaux hétéro-oligomériques (sous-unités de type III) apparaît au début du phylum des chordés, et croît jusqu'à la séparation des lignées des sauropsidés et des théropsidés. Cette diversification, à la fois quantitative et fonctionnelle, est parallèle à l'accroissement de complexité des systèmes cholinergiques. Un lien entre une complexité combinatoire accrue des assemblages de sous-unités et une plus grande plasticité de fonctionnement de ces systèmes est possible.

9.6 Glossaires des termes de phylogénie employés dans le chapitre

Autapomorphie

Une autapomorphie est un caractère dérivé, présent chez un seul des descendants. Il n'est pas utile pour reconstruire des phylogénies.

Cladistique

[153] A l'origine appelé systématique phylogénétique, le terme recouvre trois concepts.

• Il s'agit avant tout de l'idée que les organismes (ou les séquences) doivent être classés selon leur généalogie plutôt qu'en suivant les ressemblances globales. Tous les caractères ne sont alors pas équivalents d'un point de vue taxonomique. Il faut évacuer les caractères convergents, ainsi que les reversions (les deux étant appelés des homoplasies). On ne peut plus considérer la ressemblance globale, mais l'état de chaque caractère.
• Ensuite, il s'agit d'une méthode de classification. Les seuls groupes valides sont constitués d'un ancêtre et de tous ses descendants. On peut scinder un groupe de rang donné en groupes de rang inférieur ou égal. On peut fusionner des groupes de même rang en groupe de rang supérieur ou égal.
• Enfin, il s'agit d'une méthode de reconstruction phylogénétique partant de l'hypothèse que l'évolution est parcimonieuse. Autrement dit, qu'il y a un minimum d'homoplasies^9.3. On va donc considérer les différents états de tous les caractères, et choisir l'arbre (ou les arbres) qui minimise(nt) le nombre de changements.

Homologie

Deux caractères similaires sont homologues quand ils dérivent d'un ancêtre commun (les ailes des oiseaux et les bras des humains). Il y a homologie entre deux gènes si ils sont apparus par duplication. Des caractères sont homologues si

1.

Ils se ressemblent

2.

Ils ne coexistent pas dans un même organisme (p.ex. les ailes et les bras des anges ...)

3.

Ils engendrent les mêmes phylogenèses que les autres caractères homologues

Site informatif

Un caractère est informatif si il existe sous au moins deux formes, chacune présente en au moins deux exemplaires. Un caractère présentant toujours le même état, de même qu'un caractère différent dans chacun des échantillons comparés, n'est pas informatif.

Monophylie

Un groupe monophylétique est formé par un ancêtre et tous ses descendants (p.ex. les mammifères).

Orthologie

Deux orthologues sont des homologues apparus par spéciation (Le «même» gène dans deux espèces différentes : p.ex. $\alpha$1 de la torpille et $\alpha$1 de rat).

Paralogie

Deux paralogues sont des homologues apparus par duplication dans le même organisme (p.ex. $\alpha$1 et $\alpha$2 de rat).

Phénétique

[307] A l'origine, doctrine consistant à classer les êtres vivants selon les méthodes de taxonomie numérique, c.-à-d. en quantifiant les phénotypes et en utilisant les ressemblances globales pour classer les organismes. Dans le cadre des analyses de séquence, le terme recouvre les méthodes dites de «distance«.

Plésiomorphie

Une plésiomorphie est un caractère ancestral. Il n'est pas utile pour reconstruire des phylogénies.

Polyphylie

Un groupe polyphylétique est formé par différent sous-groupes, qui ne partagent aucun ancêtre commun appartenant lui-même au groupe (p.ex. les amniotes volants, oiseaux + chauve-souris).

Synapomorphie

Une synapomorphie est un caractère dérivé, partagé par un groupe monophylétique de plusieurs descendants. Les synapomorphies sont les seuls caractères utilisables pour reconstruire des phylogénies.

Footnotes

... duplication^9.1

Il est clair que le propos est de parler ici des duplications dont les descendants sont toujours présents de nos jours. Il se produit continuellement un nombre important de duplications de gène. La plupart sont létales ou tellement délétères que les organismes concernés disparaissent de la population à plus ou moins brève échéance. Finalement, dans le cas de duplications sans effet physiologique immédiat, la plupart des gènes supplémentaires sont éliminés. Il y a en effet à peu près autant de délétions de gènes que de duplications. Les produits d'une duplication ne vont perdurer que s'ils se «trouvent« des fonctions rendant leur suppression délétère [239,240].

...[97]^9.2

Cependant, un travail non publié cité dans [359] montrerait que l'habénula de Lamproie est cholinergique.

... d'homoplasies^9.3

Encore que le point de savoir si la vision cladiste requiert la minimisation de l'homoplasie est discuté (voir en particulier [101]).